TÉCNICAS DE PCR EN EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B

TEMA: Diagnóstico del virus de la hepatitis B.

OBJETIVO: Determinar el diagnóstico de la infección por el virus de la hepatitis B, mediante el proceso de PCR convencional.

MUESTRA: Suero (sangre periférica)

TIPO DE ÁCIDO NUCLEICO: ADN circular relajado (ADNrc)

EXTRACCIÓN (LISIS, SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN): Se extrajo 200 μL de suero (utilizando kit QIAamp MinElute Virus Spin), posterior se evaluó la calidad de ADN extraído (espectrofotometría Nanovue) mediante amplificación de un fragmento del gen que codifica para la β-actina (control interno). Se almacena a -89 °C hasta su uso.

GENES A ANALIZAR: Gen S (116 pb), cccDNA

TIPO DE PCR: PCR convencional

PASOS:

• DESNATURALIZACIÓN Y ACTIVACIÓN DE LA POLIMERASA: 95 °C por 10 min.

• DESNATURALIZACIÓN: 95 °C por 1 min x 35 ciclos

• HIBRIDACIÓN: 60 °C por 1 min

• ELONGACIÓN: 72 °C por 2 min

• FINAL DE EXTENSIÓN: 72 °C por 10 min

VISUALIZACIÓN: Electroforesis en gel (poliacrilamida al 6%)

Referencias bibliográficas:

1. Zhang, H., & Tu, T. (2022). Approaches to quantifying hepatitis B virus covalently closed circular DNA. Clinical and molecular hepatology, 28(2), 135–149. https://doi.org/10.3350/cmh.2021.0283

2. Zauli, D. A., Menezes, C. L., Oliveira, C. L., Mateo, E. C., & Ferreira, A. C. (2016). In-house quantitative real-time PCR for the diagnosis of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections. Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 47(4), 987–992. https://doi.org/10.1016/j.bjm.2016.07.008